Fiocruz testa diagnóstico da Hepatite B através de sangue seco e papel de filtro

diagnostico-hepatite-bNova abordagem de detecção do vírus da hepatite B, proposta por pesquisadores do IOC, utiliza sangue seco em papel de filtro. Resultados apontam confiabilidade, menor custo e maior facilidade de uso da estratégia, que seria útil em contextos de recursos limitados.


A infecção pelo vírus da hepatite B (HVB) é a segunda causa de hepatites virais no Brasil, segundo dados do Ministério da Saúde. Atualmente, o diagnóstico da doença é feito a partir de amostras de soro ou de plasma sanguíneo, o que torna indispensável a punção venosa do sangue dos pacientes. Em locais de difícil acesso, este método de detecção mostra-se, em muitos casos, inviável, pois exige equipamentos de laboratórios especializados e técnicos capacitados para coleta de sangue, além da necessidade de transporte das amostras até laboratórios de análise. Como alternativa para o diagnóstico da hepatite B, cientistas do Laboratório de Hepatites Virais do Instituto Oswaldo Cruz (IOC/Fiocruz) propõem uma nova abordagem, baseada na análise de amostras de sangue seco. A proposta mostrou-se eficaz, mais barata e de maior aplicabilidade em contextos de recursos limitados.

A ideia foi utilizar papel de filtro como base para a amostra, o que elimina a necessidade de refrigeração e facilita o transporte, combinado ao método comercial de ELISA, teste imunoenzimático utilizado na maioria dos laboratórios de diagnóstico, que permite a detecção no plasma sanguíneo de anticorpos específicos para agentes patogênicos. Para isso, foi fundamental identificar quais marcadores da presença do vírus deveriam basear a metodologia inovadora.

 

Inovação necessária

A pesquisadora Lívia Melo Villar destaca a facilidade da coleta do material como uma das principais vantagens da nova abordagem. “Com o método de análise de sangue seco, são coletadas três gotas de sangue capilar (bastante superficial, dispensando o uso de seringas) a partir da punção digital do dedo do paciente, usando-se apenas uma agulha. O método é simples, semelhante aos testes de medição de glicose. A gota de sangue do dedo é pressionada no papel de filtro. O material passa por um processo de diluição para que o sangue fixado seja retirado do papel de filtro sendo, então, submetido ao método de ELISA. “Já no método de diagnóstico convencional, o sangue é retirado por punção venosa, que deve ser realizada por um técnico especializado. Além disso, esse sangue deve ser centrifugado para obtenção do soro e, muitas vezes, essa centrifugação deve ser realizada no mesmo dia”, destaca a pesquisadora do Laboratório de Hepatites Virais do IOC, Lívia Melo Villar.

Neste caso, a inovação nasceu da necessidade: como os pesquisadores realizam trabalhos em locais distantes dos grandes centros urbanos, como nas regiões do Pantanal, da Amazônia ou do Norte do Brasil, havia dificuldade de realizar o diagnóstico nos estudos de campo. Segundo a pesquisadora, a facilidade do transporte das amostras é um ponto positivo da nova abordagem. “Com relação ao método de diagnóstico atual, o transporte do material deve ser feito em gelo seco, com temperatura refrigerada, com riscos de quebra dos recipientes. Na estratégia baseada em uso de papel de filtro, que estamos propondo, as amostras são secas e podem ser enviadas em temperatura ambiente pelo correio, logicamente dentro de todas as regras de biossegurança”, descreve a especialista.

 

Método e adaptações

Três marcadores são utilizados como referência para o diagnóstico da hepatite B: HBsAG (presente no início da infecção), anti-HBc (que aponta se o indivíduo teve contato com o vírus) e anti-HBs (capaz de sinalizar se o indivíduo está imunizado para o vírus). O estudo avaliou a otimização do método comercial de ELISA para detectar esses marcadores do HVB utilizando-se papel de filtro. Foram estudadas 523 amostras coletadas entre 2007 e 2008. Este conjunto foi dividido em quatro grupos, com o objetivo de avaliar a sensibilidade e especificidade, além da estabilidade da amostra.

“O teste comercial de Elisa é convencionalmente utilizado para testar amostras de soro, mediante determinado volume em cada amostra. Como nossa proposta consistia no uso de papel de filtro, em que há um volume menor de soro, foi preciso avaliar a viabilidade do volume presente no papel de filtro. Para este teste, usamos um conjunto com 65 amostras. Para os estudos de viabilidade, que estabelece se o teste é viável para uma análise mais aprofundada, um número mínimo 30 de amostras foram empregados. Já para avaliar a sensibilidade e especificidade, que assegura se o teste é confiável e está realmente funcionando, usamos um conjunto maior, com 422 amostras”, detalha a especialista.

“Na avaliação da estabilidade, analisamos seis amostras, sendo três pessoas com e três pessoas sem cada um desses marcadores. Essas amostras foram mantidas em diferentes condições de temperatura, dentro, por exemplo, de sacolas plásticas, para simular as condições de umidade da região amazônica, na geladeira e no freezer, com o intuito de verificar até quanto tempo era possível detectar cada marcador no papel de filtro sem interferência com relação à temperatura”, completa Lívia.

Amostras de sangue venoso, usado para a obtenção do soro (adotado nas técnicas atuais), e sangue capilar, coletado no papel de filtro (testado na metodologia proposta), foram coletadas no mesmo momento, a fim de comparar os resultados e verificar a sensibilidade do novo método em relação ao método convencional. A pesquisadora explica que para realização do teste foram necessárias algumas adaptações. “Para todos os três marcadores de HBV, foram aumentados os volume de amostras, ou seja, foram colocadas mais amostras do que o recomendado pelo fabricante, por que o sangue obtido no papel de filtro possui menor quantidade de soro. Modificamos também o ponto de corte, que define quais amostras são positivas e quais são negativas. A curva ROC, escala numérica que determina a sensibilidade e a especificidade da amostra e permite identificar os resultados positivos e negativos, foi utilizada para estabelecer um novo ponto de corte”, relata Lívia.

 

Resultados

Os resultados do estudo mostram uma correlação entre a detecção de marcadores do vírus da hepatite B em amostras de soro e de sangue seco e confirmam que o método comercial de ELISA pode ser adaptado de forma eficaz para o uso de amostras de sangue seco. De acordo com Lívia, as descobertas são promissoras porque indicam a viabilidade de um teste, de menor custo e mais facilmente disponível.

“Os resultados para sensibilidade foram de 90,5% anti-HBc, 97,6% HBsAg, e 78% para anti-HBs. Com relação à especificidade obtivemos 92,6% para anti-HBc, 96,7% para o HBsAg e 97,3% para anti-HBs, o que assegura que o teste é confiável. A pesquisa mostrou também que os marcadores do vírus pode ser detectado em amostras de sangue seco até 63 dias após a coleta, em temperatura ambiente”, comemora a pesquisadora. “A iniciativa poderá ampliar o acesso ao teste em locais de difícil acesso, favorecendo a realização de estudos de prevalência da hepatite B em várias regiões do Brasil”, Lívia sintetiza. 

 

Sobre a hepatite B

A hepatite B é transmitida pelo contato com sangue ou secreções corporais contaminadas pelo vírus. Assim, transfusões de sangue, relações sexuais sem camisinha e compartilhamento de agulhas, seringas e objetos perfurocortantes são as principais formas de contaminação. Mães portadoras podem contaminar seus filhos durante a gestação, parto e, em casos muito raros, amamentação.

 

Autora: Cristiane Albuquerque
Fonte: Comunicação / Instituto Oswaldo Cruz