Diagnóstico de rotavírus A em apenas 24 horas

diagnostico-rotavirus-vacinaO combate ao rotavírus no Brasil conta, desde março de 2006, com um importante aliado: a vacinação gratuita, incluída no calendário nacional de imunizações. A vacinação, no entanto, coloca um desafio para os cientistas: o rotavírus tipo A – o maior responsável por casos de gastrenterite infantil aguda em todo o mundo – pode apresentar uma série de pequenas variações genéticas, compondo um conjunto de diferentes genótipos. Por isso, eventualmente, mesmo uma criança vacinada poderá ser infectada e apresentar um quadro menos grave de gastrenterite aguda. Quando a criança se infecta pelo genótipo G1P[8] – que é o mesmo genótipo utilizado na produção da vacina Rotarix®, adotada no Brasil –, como, então, diferenciar se a amostra clínica da criança tem a presença de vírus vacinal ou selvagem?


Na busca de uma resposta para esta pergunta, os pesquisadores do Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental do Instituto Oswaldo Cruz (IOC/Fiocruz), que atua como referência em rotaviroses junto ao Ministério da Saúde, estudou quais seriam mais adequado para uma diferenciação segura. O resultado é um método inovador, eficaz, altamente específico e que pode ser executada em apenas 24 horas, o que é indispensável na investigação de situações de crianças vacinadas que foram novamente infectadas pelo rotavírus A.

 

Rotavírus e vacinação

Os rotavírus A estão associados às gastroenterites agudas e são responsáveis pela morte de aproximadamente 511 mil crianças menores de cinco anos, anualmente, principalmente nos países em desenvolvimento. São transmitidos principalmente pelo contato oro-fecal, por água, alimentos e superfícies contaminadas, e pelo contato direto com pessoas infectadas, provocando um quadro de diarreia, vômito e febre branda nos pacientes.

A vacinação é a metodologia de controle mais eficaz contra o rotavírus, pois reduz a forma grave da doença. Para que consiga induzir imunidade para a doença, a vacina inclui em sua formulação partículas virais que foram atenuadas. No Brasil, a vacina adotada pelo Ministério da Saúde é a monovalente (G1P[8] / Rotarix®).

 

Joio e trigo

O Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental do IOC propõe uma nova abordagem para realizar a diferenciação. “Atualmente, temos crianças que foram imunizadas com doses da vacina e que depois foram infectadas com rotavírus A. Então, a principal questão proposta pelo estudo é diferenciar, em uma determinada amostra, primeiramente se existe a presença do genótipo G1P[8] do rotavírus A e, em segundo lugar, analisar se este genótipo é de origem selvagem ou vacinal”, explica José Paulo Leite, chefe do Laboratório e coordenador da pesquisa.

No estudo, os pesquisadores analisaram o genoma viral (chamado dsRNA, um RNA de dupla fita, contendo 11 segmentos) em amostras de três diferentes lotes da vacina Rotarix®. A partir das amostras, foram sequenciados dez dos onze genes do rotavírus A que codificam proteínas estruturais (VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 e VP7) e não estruturais (NSP1, NSP3, NSP4 e NSP5). Estes genes foram amplificadas por técnicas de amplificação genômica (RT-PCR).

“Foi realizada uma análise in silico, que comparou as sequências que conseguimos obter e aquelas sequências disponíveis no GenBank para todos os genótipos de rotavírus”, descreve o pesquisador. Por meio do estudo, foi observado que o gene que codifica para a proteína não estrutural NSP3 mostrou ser o mais adequado, permitindo a diferenciação de maneira mais fácil entre os genótipos G1 de origem vacinal e selvagem.

“Atualmente, é preconizado o uso do gene que codifica para a NSP3 para se fazer o diagnóstico de rotavírus A pela metodologia de amplificação genômica quantitativa. Observamos que, pelo fato de possuir uma mutação única, este gene se enquadraria em nossa proposta, que consistia em obter um método fácil e relativamente rápido para fazer a distinção entre a amostra vacinal e selvagem dos rotavírus A genótipo G1”, destacou Tatiana Rose, pesquisadora visitante do Laboratório de Virologia Comparada e Ambiental do IOC. A metodologia proposta tem como base a amplificação parcial do gene que codifica para a proteína NSP3, seguido de analise com a endonuclease de restrição BspHI’.

 

Vantagens

Anteriormente, um grupo holandês havia demonstrado a diferença entre amostra selvagem e vacinal do rotavírus A, com base na análise do gene VP7. Na proposta, foi utilizado um processo chamado de ‘hibridização líquida’. Além de ter um custo mais elevado, essa metodologia é mais longa, levando em média 48 horas para ser concluída.

“Da mesma maneira que o método de hibridização líquida, o nosso método discrimina o tipo selvagem e vacinal com base em uma diferença em um único nucleotídeo. Porém, a técnica que desenvolvemos apresenta como principais vantagens o menor risco de reação cruzada e o menor custo em comparação a outros métodos publicados”, compara o especialista José Paulo Leite.

 Já para Tatiana Rose, outra vantagem do método é a redução do tempo de análise e a mão de obra necessária. “A técnica que utilizamos é mais rápida e sensível para distinguir entre o gene NSP3 da vacina Rotarix® do gene NSP3 da amostra selvagem do rotavírus A. Com o nosso método, em 24 horas é possível saber se a amostra é vacinal ou selvagem”, ressalta a pesquisadora.

“Este trabalho possui uma importância muito grande em saúde pública, particularmente, no Brasil, na América Latina e nos países que adotaram a vacina Rotarix®. O monitoramento dos genótipos circulantes é fundamental e a diferenciação entre amostras de genótipos G1 de origem vacinal e selvagem é crucial. Temos assim a possibilidade de avaliar o impacto do esquema vacinal na prevalência dos genótipos mais comuns, no surgimento de genótipos que ‘escapam’ à imunização, e nos permite ainda estudar a evolução dos rotavírus A”, justifica José Paulo.

O estudo foi publicado na revista científica Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. “Esta pesquisa poderia ser publicado em revistas científicas de virologia editadas no exterior, porém optamos por publicar em revista científica indexada brasileira. Por quê? Porque este trabalho teve apoio financeiro do Ministério da Saúde (IOC/Fiocruz), do CNPq, da Capes e da Faperj, foi integralmente realizado no Brasil e, assim, estamos valorizando o que é brasileiro”, finaliza o pesquisador.

Fonte: O Texto é de Cristiane Albuquerque - Agência Fiocruz