Cromatografia Líquida De Alta Eficiência - HPLC

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE ou HPLC) se desenvolveu muito nos últimos anos, recebendo o nome de cromatografia líquida por que a sua fase móvel é um solvente.

Os componentes de um cromatógrafo líquido são: bomba, coluna cromatográfica, detector e o registrador. É um método utilizado para separação de espécies iônicas ou macromoléculas e compostos termolábeis.

A fase móvel da CLAE deve ser um solvente que respeite algumas características impostas por esse método analítico. A principal característica é que a fase móvel dissolva a amostra sem qualquer interação química entre ambas. Esta fase deve ter alto grau de pureza ou ser de fácil purificação, para que se possam fazer análises de alta sensibilidade, pois as impurezas podem interferir na detecção do analito por ultravioleta (UV). A fase móvel deve ser compatível com o detector empregado e, também possuir polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos componentes da amostra. Embora existam vários solventes, três deles são mais utilizados: água, metanol e acetonitrila.

Como fase estacionária utilizam-se sólidos ou semirígidos, cujas partículas porosas esféricas ou irregulares apresentam diferentes diâmetros e suportam pressão até 350 bar.

A coluna cromatográfica é feita de um material inerte que resiste a todas as pressões em que ela vai ser usada. A capacidade da coluna é determinada pelo comprimento, diâmetro e pelo material de recheio. As colunas geralmente utilizadas são: octadecil (C18, RP18, ODS), octil (C8, RP8), CN (cianopropil) e NH2 (amina). Quanto aos detectores, não existe um que apresente todas as propriedades para que ele seja ideal para CLAE. Não são versáteis, ou universais, mas existem detectores que apresentam ampla faixa de aplicações. A sensibilidade de um detector é determinada a partir da relação entre o sinal produzido e a quantidade de amostra que gera este sinal. A linearidade é a faixa linear do sistema, onde o sinal do detector é diretamente proporcional à concentração do soluto.

Os detectores mais usadas na CLAE são os fotométricos, baseados na absorbância no ultra violeta e no visível. Os detectores de fluorescência, utilizados como método de detecção específica, são sensíveis para substâncias que fluorescem. Este tipo de detector pode detectar quantidades de ordem picograma. Também são utilizados detectores por índice de refração, os quais acompanham continuamente a diferença no índice de refração entre a fase móvel pura e o efluente que sai da coluna contendo os componentes da amostra. A resposta deste detector é moderada, geralmente de ordem micrograma.

Esquema de um sistema de HPLC

Técnicas cromatográficas:

A- Cromatografia de adsorção

Nesta a fase estacionária é sólida e a fase móvel pode ser líquida ou gasosa. Esta baseia-se nas diferentes afinidades adsorventes da superfície da fase estacionária pelas moléculas da substância a separar.

B- Cromatografia de partição

Nesta fase a fase estacionária é líquida. Este processo é baseado na diferente solubilidade dos componentes da mistura nas duas fases líquidas.

Cromatografia em camada fina (plana) (TLC): a retenção das substâncias deve-se à adsorção sofrida na superfície da fase estacionária, colocada sobre um dos lados de uma placa de vidro ou metal.

Cromatografia em coluna: utiliza-se uma coluna de vidro aberta na parte superior e munida de uma torneira na extremidade inferior, por onde sai o líquido (eluído). Dentro da coluna encontra-se a fase estacionária constituída por um enchimento sólido no caso da cromatografia de adsorção, ou por uma fase líquida no caso da cromatografia de partição. A fase móvel é líquida em ambos os casos.

Cromatografia em papel (plana): a retenção das substâncias é devida à partição das duas fases líquidas, uma móvel e outra estacionária, sendo esta constituída pelo líquido absorvido no papel. Encontra-se bastante divulgada devido à sua facilidade experimental e ao seu baixo custo.

Este é o tipo que será utilizado na aula prática. Usualmente, trabalha-se com papel Whatmann, com a devida especificação (número 4 por exemplo).

Para efeito de facilidade vamos enumerar alguns termos de uso corrente:

a) Cromatografia - consta de papel devidamente tratado, ou seja, cortando de acordo com as dimensões da câmara onde será colocado, no qual fizemos "manchas" de soluções padrões ou de soluções problemas.

b) Câmaras cromatográficas - são os recipientes, hermeticamente fechados, onde os cromatogramas são desenvolvidos;

c) Linha básica - é a linha traçada, geralmente a três centímetros do bordo inferior do papel, sobre o qual distribuímos as "manchas" de solutos.

Alguns cuidados que devem ser tomados:

a) antes de ser iniciar o processo cromatográfico, a câmara, contendo a mistura de solvente, já deve estar saturada de seus vapores,

b) o solvente não deve correr até o bordo superior do papel (cuidado com o número de horas de processamento) e nem tampouco uma pequena distância. De preferência até uns 2 a 3 cm do bordo superior.

Os tipos de câmara cromatográfica variam de tamanho e forma, desde as mais bem trabalhadas, até a um simples tubo de ensaio ou proveta.

As modalidades de cromatografia em papel são as mais variadas possíveis. Temos cromatografia ascendente e descendente, mono e bidimensional, vertical e horizontal.